Năm 1532, sau khi trở về Dover từ Calais, Henry VIII và Anne Boleyn bí mật kết hôn vào ngày 14 tháng 11, Anne ngay lập tức mang thai. Vào đầu năm sau (1533), ngày 25 tháng 1, để cho hôn nhân giữa Vua Henry và Catherine chính thức bị xem là phạm pháp, Anne và nhà Vua đã tổ chức một buổi lễ long trọng hậu đám cưới ở London. Vua Henry tuyên bố bảo vệ cuộc hôn nhân này bằng cách chỉ điểm rằng Catherine và Arthur đã từng kết hôn, và nếu cả hai đã động phòng, điều mà nhà vua quả quyết bất chấp lời biện hộ của Catherine, thì nhà vua có quyền tái hôn bất kỳ lúc nào.

Ngày 23 tháng 5 cùng năm, Thomas Cranmer thăng tọa Hội nghị tại Tu viện Dunstable, tuyên bố hôn nhân giữa Henry VIII và Catherine đã không còn giá trị. Sau đó 5 ngày, tức ngày 28 tháng 5, Cranmer tuyên bố hôn nhân giữa Henry VIII và Anne Boleyn chính thức có hiệu lực[91]. Mặc dù vậy, từ đây đến tận khi qua đời, Catherine vẫn tự xưng mình là Vương hậu hợp pháp duy nhất, và không công nhận danh vị của Anne Boleyn. Vua Henry VIII, không chấp nhận sự cứng rắn này của Catherine, chỉ xưng bà là 「Dowager Princess of Wales」, tức "Vương thái phi xứ Wales", trong trường hợp này đã xác định rõ Catherine chỉ là góa phụ của anh mình[92].

Khoảng thời gian này, vào mùa đông, bà chuyển đến Dinh thự The More, rồi lại Lâu đài Buckden, và đến năm 1535 thì bà lại chuyển sang Lâu đài Kimbolton, tại vùng Kimbolton, thuộc địa phận Huntingdonshire của Cambridgeshire, miền Đông của nước Anh. Từ đây đến khi qua đời, bà được ghi nhận không bao giờ rời khỏi Lâu đài, trong phòng bà mặc một áo bằng vải tóc (cilice) dành cho các Tín đồ dòng Phan Sinh, bà cầu nguyện và thường xuyên ăn chay. Từ khi bị điều đi khỏi triều đình Anh, Catherine bị cấm không được qua lại với con gái Mary, kể cả viết thư, mặc dù những người hầu và trung gian đã rất thông cảm với tình trạng của hai mẹ con mà vẫn lén lút giúp họ chuyển thư từ cho nhau. Nhận thấy như vậy, Vua Henry cho họ cơ hội có thể gặp nhau và sống cùng nhau, miễn rằng cả hai đều phải công nhận danh vị của Anne Boleyn. Và dù rất yêu thương nhau cùng sự xa cách dày vò cả hai, nhưng cả hai mẹ con Catherine đều nhất quyết không đồng ý[93].

Vào khoảng tháng 12 năm 1535, Catherine cảm mấy mình đang hấp hối, nên viết di chúc cho cháu trai là Hoàng đế Karl V, chủ yếu là gửi gắm Mary cho ông. Ngoài ra, có một bức thư được cho là chính bà viết để gửi cho Henry VIII, người mà bà gọi là "Most dear Lord and husband" (tức "Người chồng và chúa tể kính mến")[94]. Nội dung:

My most dear lord, king and husband,

The hour of my death now drawing on, the tender love I owe you forceth me, my case being such, to commend myself to you, and to put you in remembrance with a few words of the health and safeguard of your soul which you ought to prefer before all worldly matters, and before the care and pampering of your body, for the which you have cast me into many calamities and yourself into many troubles. For my part, I pardon you everything, and I wish to devoutly pray God that He will pardon you also. For the rest, I commend unto you our daughter Mary, beseeching you to be a good father unto her, as I have heretofore desired. I entreat you also, on behalf of my maids, to give them marriage portions, which is not much, they being but three. For all my other servants I solicit the wages due them, and a year more, lest they be unprovided for. Lastly, I make this vow, that mine eyes desire you above all things.

Katharine the Quene.

Tác giả của bức thư này đến nay vẫn không chắc chắn, bởi vì dựa vào tính cách và sự quyết liệt của Catherine, thì lời lẽ bức thư này lại quá cầu khẩn và cảm thấy hối lỗi. Bên cạnh đó, bức thư cũng có nhiều dị bản khác nhau, càng cho thấy rất có khả năng là phóng tác[95].

Ngày 7 tháng 1 năm 1535, Catherine xứ Aragon qua đời tại Lâu đài Kimbolton, thọ 50 tuổi. Hôm ấy, María de Salinas đến và chăm sóc bà, sau khi thực hiện thú tội trước Chúa và được sức dầu thánh được gọi là 「Anointing of the sick」[96]. Ngày hôm sau, khi tin tức về cái chết của bà truyền đến tai Henry VIII, thì cũng lại có tin bà bị đầu độc[97][98][99], và người thực hiện có khả năng là Gregory di Casale[100]. Khi nhận được tin, Henry và Anne đã vui mừng khôn xiết, và sang ngày hôm sau nữa thì cả hai đều bận trang phục màu vàng, biểu tượng của hân hoan tại Anh, và tổ chức một bữa tiệc linh đình[101]. Việc làm này của cặp đôi đã bị nhiều sử gia phỉ nhổ và ghê tởm. Trong khi đó, lại có thuyết rằng ở Tây Ban Nha, màu vàng là biểu tượng của tang tóc, trái ngược với màu đen, do vậy có ý kiến cho rằng Anne và nhà vua đã thực sự đang để tang Catherine. Nhưng lý do biện hộ này rất khiên cưỡng, và hành động này của Anne Boleyn được cho là để giảng hòa với con gái của Catherine là Mary[102]. Trước điều đó, Mary cự tuyệt gay gắt, vì cô cho rằng cái chết của mẹ mình liên quan đến hai vợ chồng, có khả năng Catherine đã bị đầu độc bởi Henry hoặc Anne. Khi khám nghiệm tử thi của Catherine, các nhà khoa học phát hiện phần tim của bà bị tái đen, sau khi xét nghiệm thì đưa ra kết luận đây là dấu hiệu của ưng thư tim thay vì đầu độc[103].

Vào ngày 29 tháng 1 năm ấy, Catherine xứ Aragon được an táng vào Nhà thờ chính tòa Peterborough. Tang lễ diễn ra khá đơn sơ và kín đáo bởi vì địa vị "Vương thái phi xứ Wales" của bà, nên tang lễ cũng không phải dành cho một Vương hậu. Quốc vương Henry VIII thậm chí còn cấm Mary đến dự tang lễ của mẹ mình[104][105].